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Jan 14, 2024Jan 14, 2024

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 12383 (2023) Citer cet article

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Les sphéroïdes tumoraux multicellulaires intégrés dans des matrices de collagène I sont des systèmes in vitro courants pour l’étude des tumeurs solides qui reflètent l’environnement physiologique et les complexités de l’environnement in vivo. Bien que les environnements de collagène I soient physiologiquement pertinents et permettent l’invasion cellulaire, l’étude des sphéroïdes dans de tels hydrogels présente des défis pour les tests analytiques clés et pour un large éventail de modalités d’imagerie. Bien que cela soit dû en grande partie à l'épaisseur des hydrogels 3D qui, dans d'autres échantillons, peuvent généralement être surmontés par section, en raison de leur nature hautement poreuse, les hydrogels de collagène I sont très difficiles à sectionner, en particulier de manière à préserver le réseau d'hydrogels, y compris les cellules. modèles d’invasion. Nous décrivons ici une nouvelle méthode de préparation et de cryosection de sphéroïdes invasifs dans une matrice à deux composants (collagène I et gélatine), une technique que nous appelons cryosection sphéroïde in vitro à double hydrogel d’échantillons tridimensionnels (DISC-3D). DISC-3D ne nécessite pas de fixation cellulaire, préserve l'architecture des sphéroïdes invasifs et de leur environnement, élimine les problèmes d'imagerie et permet d'utiliser des techniques rarement appliquées dans l'analyse de sphéroïdes tridimensionnels, notamment la microscopie à super-résolution et l'imagerie par spectrométrie de masse. .

L’étude in vitro de cellules cultivées sur des substrats plats bidimensionnels (2D) est utilisée depuis plus d’un siècle et a joué un rôle crucial dans d’innombrables découvertes scientifiques. Bien que la culture cellulaire 2D continue d’être une méthode standard en biologie moléculaire et cellulaire, on comprend depuis longtemps qu’elle ne peut pas récapituler les aspects critiques des systèmes in vivo, notamment les interactions tridimensionnelles (3D) cellule-cellule et cellule-environnement1. De telles interactions sont particulièrement importantes dans l’étude des processus cellulaires explicitement émergents et multicellulaires ; par exemple, dans le développement et la croissance et la progression d'une tumeur solide.

Ces dernières années, la culture cellulaire 3D a été de plus en plus utilisée2. Ici, les entités multicellulaires sont cultivées ou préparées à partir de lignées cellulaires ou de tissus de patients, généralement appelés respectivement sphéroïdes et organoïdes, et cultivées dans des hydrogels synthétiques ou naturels qui imitent la matrice extracellulaire in vivo. Il a été démontré que la culture cellulaire tridimensionnelle reproduit mieux la physiologie des tissus humains, comme les gradients de nutriments et d'oxygène, les différentes zones de prolifération et les interactions cellule-cellule et cellule-matrice, ce qui justifie clairement l'utilisation de la culture 3D pour étudier des questions biologiques. de nature multicellulaire3,4,5,6. Parmi les hydrogels 3D, les environnements de collagène I présentent une importance physiologique particulière pour de nombreuses tumeurs solides. Dans le cancer du sein, une densité élevée de collagène I est un facteur de risque connu de développer une maladie7,8 et une densité particulière et une organisation aérienne des fibres de collagène autour des tumeurs sont associées au pronostic9. Les interactions entre les cellules et le microenvironnement stromal riche en collagène sont également importantes dans le cancer du pancréas10,11 et ont été impliquées dans divers autres cancers12. Le collagène I constitue également un environnement attrayant pour la culture cellulaire 3D, car sa biochimie et sa structure en réseau favorisent une invasion cellulaire efficace. De plus, il s’agit d’un environnement dans lequel les propriétés physiques, telles que la largeur des fibres, la taille des pores et la rigidité de l’hydrogel, peuvent être facilement ajustées sans altérer la composition biochimique, permettant ainsi d’étudier les effets de ces propriétés sur le mode et l’efficacité de l’invasion cellulaire13,14,15,16. .

Bien qu'il soit bien établi que la culture cellulaire 3D, et les hydrogels de collagène I en particulier, offrent un degré élevé de pertinence physiologique et des opportunités de démêler l'importance de la biochimie des propriétés physiques sur le comportement cellulaire, l'adoption de la culture cellulaire 3D a été relativement peu répandue. lent. Cette réticence provient en partie des défis associés à l’acquisition d’images de microscopie optique à haute résolution dans de tels environnements6. Les cellules détectent et réagissent à la rigidité de l’environnement sur des distances d’au moins plusieurs dizaines, et sans doute bien au-delà d’une centaine de microns17. Ainsi, pour que les cellules se comportent comme elles le feraient dans un environnement 3D isotrope, elles doivent être positionnées bien au-dessus des substrats d’imagerie rigides. Cela peut entraîner le fait que les cellules se trouvent au-delà de la distance de travail des objectifs à ouverture numérique élevée typiques, un signal de fond élevé dû à la diffusion depuis l'extérieur du plan d'imagerie et une autofluorescence des cellules ou de l'hydrogel entourant les cellules. De plus, l’environnement 3D peut entraver la diffusion de petites molécules ou d’anticorps à travers l’échantillon, inhibant à la fois les études de médicaments et l’introduction de marqueurs fluorescents dans ces contextes. Les défis associés aux échantillons 3D peuvent être particulièrement aigus dans les approches les plus riches en informations telles que l'imagerie optique à super-résolution, où un signal/bruit élevé est primordial, les approches corrélatives dans lesquelles plusieurs modalités sont employées et les approches non optiques telles que la spectrométrie de masse. imagerie où la diffusion à partir d’échantillons épais empêche la collecte de données sauf à la surface de l’échantillon.

 0.05 (n = 12, 59, and 46 slices for 3D, DISC-3D, and DISC-3D re-stained, respectively)./p> 0.05./p> 100 μm into the gel [3D high], and (bottom) following DISC-3D preparation (4 μm slices). From left to right, the columns show images taken using widefield microscopy, confocal microscopy, Airyscan imaging, lattice SIM, and STORM in a HILO implementation. No image is presented for 3D STORM imaging in the top two rows because (3D low) filtering out-of-plane light was insufficient or (3D high) the technique could not be implemented at such depths. Scale bar = 20 μm. (b) Mean measured full width at half maximum (FWHM) of collagen fibers from each microscopy technique. Error bars show standard deviation. Expected minimum FWHM of each approach is shown via dashed horizontal lines. (c) Pore size of collagen networks determined across imaging techniques and sample preparations (see Methods for details). Error bars show standard deviation. Statistical significance, number of samples assessed, and additional information about resolution of each technique are provided in Fig. S4./p> 100 μm into the gel, referred to as 3D high, middle row), and following DISC-3D preparation and cryosectioning (bottom row). All gels investigated were subjected to the first portion of the DISC-3D protocol, the addition and gelation of gelatin. Thus, the only difference between the samples in the DISC-3D images (bottom row) and the other samples (top and middle rows) is that the DISC-3D samples were frozen, removed from the sample wells, and sectioned. First, we note that qualitatively, images of the hydrogel collected near the coverslip appear similar to images of DISC-3D samples across techniques, suggesting that hydrogel structure is not adversely affected by the DISC-3D sample preparation procedure. Generally, DISC-3D samples show enhancements in image quality for all microscopy techniques explored. Widefield microscopy, which suffers from out of plane signal for 3D samples, shows obvious gains in image quality for DISC-3D samples relative to intact 3D samples (Fig. 4a, leftmost column). Confocal microscopy, Airyscan, and SIM, while providing excellent image quality and revealing consistent fiber morphology low in the gel, also show declines in image quality at increased imaging depths (Fig. 4a). We note that imaging at such depths assures the cells interrogated do not sense the underlying stiff substrate; therefore, maximizing image quality in this region is critical for studying cell behavior in a physiologically relevant context. STORM images were poor, and fibers were difficult to discern both low and high in the 3D gels, ostensibly due to challenges filtering out of plane emission in this highly scattering sample, as such filtering is critical to identification and localization of single fluorophores. The enhancement in image quality observed for DISC-3D samples opens the door to revealing details about system microstructure that would not otherwise be accessible in traditional 3D culture contexts./p> 0.95, Fig. S4a). For most microscopy techniques explored here, we find fiber widths larger than the expected fiber thickness of 50–100 nm, consistent with the measured resolutions of these techniques (Fig. 4, Fig. S4c). Given that the true fiber width falls below measured resolutions for widefield, confocal, Airyscan, and SIM, only STORM imaging—which can only be applied to DISC-3D samples—can accurately report fiber thickness (Fig. 4b). Here, we find a fiber width of approximately 75 nm in DISC-3D samples, in good agreement with measurements by electron microscopy and atomic force microscopy46./p> 0.05. (d,e) Representative normalized mass spectra collected from invasive spheroids following the DISC-3D protocol at (d) 24 °C and (e) 350 °C demonstrating the increase in signal intensity in the ≈ 650–900 m/z regime. Number at right on each panel indicates maximum intensity peak at that temperature. (f) Representative mass spectrometry images prepared following the DISC-3D protocol outlined in Fig. S1d, showing consecutive sections of single spheroids for several signal ions. In the first serial section of each signal ion, the spheroid core is marked by a white dotted line and the invasive front is denoted by a red dotted line. Color scale from minimum to maximum intensity is shown for signal ions at right. Scale bar = 500 μm./p> 100 photons) and standard deviation of the fitted Gaussian (> 50 nm and < 250 nm) to remove noise and poor-quality fits. Noise was further reduced by using a DBSCAN-based filter to remove outlier molecules in sparsely populated regions of the imaging area (Epsilon = 50 nm, MinPts = 5). After these post-processing steps, images were drift-corrected using cross-correlation with a bin size of 5. Molecules in post-processed and drift-corrected images were visualized using the “Normalized Gaussian” rendering with a lateral uncertainty set to 10 nm./p> 0.05) is denoted by a dagger (†). A denotes statistical significance and is described in the relevant figure caption when employed./p>

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