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La ségrégation temporelle des processus biosynthétiques est responsable des oscillations métaboliques au cours du cycle cellulaire en herbe de la levure.

Oct 24, 2023Oct 24, 2023

Nature Metabolism volume 5, pages 294-313 (2023)Citer cet article

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De nombreux mécanismes biologiques et biochimiques cellulaires contrôlant le processus fondamental de division cellulaire eucaryote ont été identifiés ; cependant, la dynamique temporelle des processus de biosynthèse au cours du cycle de division cellulaire reste encore insaisissable. Ici, nous montrons que les processus biosynthétiques clés sont temporellement ségrégués tout au long du cycle cellulaire. En utilisant la levure bourgeonnante comme modèle et des méthodes unicellulaires pour mesurer dynamiquement l'activité métabolique, nous observons deux pics de synthèse protéique, dans les phases G1 et S/G2/M, alors que la synthèse des lipides et des polysaccharides ne culmine qu'une seule fois, pendant la phase S/G2. Phase /M. En intégrant les taux de biosynthèse déduits dans un modèle métabolique thermodynamique-stoechiométrique, nous constatons que cette ségrégation temporelle dans les processus biosynthétiques provoque des changements de flux dans le métabolisme primaire, avec une accélération du flux d'absorption du glucose dans G1 et des oscillations déphasées des échanges d'oxygène et de dioxyde de carbone. . Grâce à la validation expérimentale des prédictions du modèle, nous démontrons que le métabolisme primaire oscille avec la périodicité du cycle cellulaire pour satisfaire les demandes changeantes des processus de biosynthèse présentant une dynamique inattendue au cours du cycle cellulaire.

La croissance et la division cellulaire sont des processus biologiques fondamentaux. Bien que nous disposions d’une solide connaissance des mécanismes biologiques et biochimiques cellulaires contrôlant le cycle de division cellulaire, nous en savons beaucoup moins sur la dynamique temporelle de la biosynthèse et du métabolisme primaire qui déterminent la croissance cellulaire au cours du cycle cellulaire. Alors que l’on sait que la biosynthèse de l’ADN est limitée dans le temps au sein de la phase S, la dynamique d’autres processus biosynthétiques majeurs, tels que les synthèses de protéines et de lipides, reste floue ; les processus de biosynthèse sont-ils constamment actifs tout au long du cycle cellulaire ? Si leurs activités changent, les taux des différents processus de biosynthèse changent-ils de la même manière ? Une telle connaissance est essentielle pour découvrir les mécanismes à l’origine de la régulation de la croissance cellulaire, dont les défauts sont associés à la maladie1,2.

Actuellement, on considère que la synthèse des protéines augmente à un rythme exponentiel ou constant tout au long du cycle cellulaire de la levure, comme le déterminent des études au niveau de la population avec marquage radioactif3,4,5 et des analyses unicellulaires6,7. Cependant, nous avons récemment découvert que le taux de production de protéine fluorescente verte (GFP) contrôlé par le promoteur endogène TEF1 culmine dans G1 (réf. 8), ce qui suggère que l'activité de biosynthèse des protéines pourrait en réalité être non monotone au cours du cycle cellulaire. Cette découverte serait cohérente avec un pic observé d'abondance de protéines ribosomales dans G1 (réf. 9), bien que d'autres n'aient trouvé aucune dynamique de ce type10. De même, l'expression de gènes associés à la biogenèse et à la traduction des ribosomes a également été observée avec un pic dans G1 (réf. 10, 11); cependant, des études de séquençage d'ARN unicellulaire (RNA-seq) ont rapporté soit seulement une légère augmentation de l'ARNm de la protéine ribosomale dans G1 (réf. 12), soit aucune différence notable au cours du cycle cellulaire13. Comme pour d’autres classes de macromolécules, telles que les lipides et les acides nucléiques, il a également été suggéré que leur biosynthèse s’accélère au cours de certaines phases du cycle cellulaire selon des études multi-omiques récentes9,10. Pourtant, les abondances moléculaires mesurées dans ces études ne fournissent qu’une preuve indirecte des taux de biosynthèse réels. Ainsi, la dynamique temporelle des activités biosynthétiques au cours du cycle cellulaire reste encore largement insaisissable. Répondre à cette question nécessitera probablement de mesurer les taux de manière dynamique et résolue en fonction du cycle cellulaire, ce qui pose jusqu'à présent d'énormes défis techniques.

Ici, en utilisant la levure bourgeonnante comme modèle et en utilisant la microscopie dynamique à fluorescence unicellulaire avec une nouvelle méthode d'arrêt et de réponse, nous avons découvert que les activités de biosynthèse des protéines, des lipides et des polysaccharides ne sont ni exponentielles ni constantes au cours du cycle cellulaire. Plus précisément, nous avons constaté que la biosynthèse des protéines présente deux vagues d'activité par cycle cellulaire, alors que les activités de biosynthèse des lipides et des polysaccharides sont faibles lors de la première vague de biosynthèse des protéines en G1 mais élevées au cours de la deuxième vague en S/G2/M. Nous avons converti les modèles d'activités biosynthétiques découverts en unités absolues via un modèle mathématique de dynamique de la masse cellulaire, les avons intégrés dans un modèle métabolique thermodynamique-stoechiométrique et avons ainsi déduit la dynamique du cycle cellulaire des flux métaboliques primaires. Comme nous avons pu valider expérimentalement les changements de flux métaboliques déduits, cela a fourni des preuves supplémentaires des modèles dynamiques découverts des activités biosynthétiques et nous a également permis de conclure que la ségrégation temporelle dans les processus biosynthétiques doit être responsable des oscillations horaires du métabolisme primaire. . Nos travaux montrent que la croissance cellulaire au cours du cycle cellulaire est un agrégat de processus biosynthétiques et métaboliques primaires ségrégués dans le temps, ce qui fournit des informations fondamentales sur les bases mêmes de la physiologie cellulaire.

threefold change) and respective cell growth rates (>11-fold change), which are larger spreads than those during the cell cycle (~1.4-fold change of dry mass and ~1.6-fold change of dry mass derivative, as estimated from our data). The changes in protein synthesis rate during the cell cycle that we report here could thus be well hidden in the noise of the cell mass/growth rate data from the other work57. Moreover, cellular composition changes during the cell cycle could potentially confound a direct comparison of the buoyant-mass data57 with our dry-mass-related data (as shown in formula 1 in recent work58). The authors of the paper57 have cautiously not made any conclusion on cell-cycle dynamics of cell growth rate in yeast./p> \Delta \bar t_{\mathrm{START}} \cap E^c = {\mathrm{ME}}\), \(\varphi ^c > \Delta \bar t_{\mathrm{BUD}} \cap E^c = {\mathrm{START}}\) or \(\varphi ^c > \Delta \bar t_{CC} \cap E^c = {\mathrm{BUD}}\). Therefore, we arrived to a smaller or the same set of cells \(S2,\left| {S2} \right| \le \left| {S1} \right|,\) for which we associated the NAD(P)H derivative value Pc with the position in cell cycle φc when perturbation happened. Besides, for each cell \(c \in S2\), we stored the information about the kind of the cell-cycle event closest to perturbation, Ec./p> \overline {F_i} \left( {15 \times 15} \right) + p30\), where Fi is the pixel’s intensity, \(\overline {F_i} \left( {15 \times 15} \right)\) – the mean intensity among the nearest 15 × 15 pixels (roughly, a third of the mother cell) and p30 – the thirtieth percentile among the mother cell’s pixels (Python’s method skimage.filters.threshold_local with block_size = 15, method = ‘mean’, offset = p30 and mode = ‘nearest’). Using the offset p30 helps to discard a small number of cytoplasmic pixels that due to noise happen to be brighter than their neighbors. For the same purpose, after the local thresholding, we removed objects (ensembles of selected pixels) smaller than 25 pixels and having the connectivity equal to 1 (two pixels are connected by one orthogonal step). Eventually, we segmented one object containing the brightest pixels, which represents nucleus. If some pixels inside this object were not selected in the local thresholding (due to noise, some single pixels may be dimmer), then we added these pixels to the selection. To calculate the abundance of the fusion Hta2-mRFP in the mother-cell nucleus, we summed the intensities of the pixels located within the segmented nucleus. Microscopy image processing was performed in Python with the help of the module skimage./p> 0\), where Sij is the coefficient of j = ATP in the reaction i that has the flux \(v_i^{\mathrm{cell}}\left( t \right)\) (mol cell−1 h−1) (due to the steady-state assumption of FBA, the turnover values would be the same if ATP-depletion fluxes only were summed). We showed individual reactions i whose cytoplasmic flux of j = ATP calculated as \(S_{ij}\,v_i^{\mathrm{cell}}\left( t \right)\) is bigger than 0.09 or smaller than −0.09 (mol cell−1 h−1) in at least one cell-cycle phase. In Fig. 4d, for each precursor, we calculated the sum of its fluxes, \(\mathop {\sum}\nolimits_i {S_{ij}v_i^{\mathrm{cell}}(t)}\), in the reactions diverting from central metabolic pathways to the synthesis of major biomass components: for ribose 5-phosphate (r5p), its fluxes in the syntheses of AMP, GMP and UMP as well as phosphoribosyl pyrophosphate; for erythrose 4-phosphate (e4p), its flux in the synthesis of 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate 7-phosphate; for phosphoenolpyruvate (pep), its fluxes in the reactions of 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthetase and 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase; for pyruvate (pyr), the l-alanine flux in the reaction of protein biosynthesis; for acetyl-CoA (accoa), its fluxes in the reactions of zymosterol synthesis, homoserine O-trans-acetylase, 2-isopropylmalate synthase and lipid biosynthesis; for glycerol 3-phosphate (g3p), its flux in lipid biosynthesis; for glucose 6-phosphate (g6p), its fluxes in polysaccharide and lipid biosynthesis; for fructose 6-phosphate (f6p), its flux in polysaccharide biosynthesis./p>

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